安博体育 - 官方体育投注平台 足球·篮球·电竞一站式服务草鱼脑芳香化酶的cDNA克隆、启动子分离与转录活性的调控pdf

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　　细胞色素P450芳香化酶能够催化雄性激素向雌性激素的转化，被认为是类固醇激素代谢过程中的一个关键酶。在硬骨鱼中存在两种芳香化酶异构体，P450AROMA和P450AROMB，分别在性腺组织和脑组织中有高表达。有趣的是，硬骨鱼的脑芳香化酶活性大约是其他脊椎动物的1001000倍，但至今对这种现象未有合理的解释。在目前的研究中，我们运用RTPCR以及快速扩增CDNA末端RACE的方法成功克隆了草鱼脑芳香化酶GCP450AROMB的CDNA序列。该序列全长共有1947BP，其中开放阅读框ORF长1527BP，可以编码509个氨基酸残基。经氨基酸序列比对发现，草鱼脑芳香化酶与其他硬骨鱼类脑芳香化酶有较高的相似性66％93％，而与性腺芳香化酶仅有约60％相似性，与哺乳动物芳香化酶有50％的相似性。运用半定量RTPCR的方法进行组织分布研究发现，在所选择的10个组织中，仅在脑和垂体腺中发现了GCP450AROMAB的MRNA表达，进一步在脑的不同区域中发现GCP450AROMB的MRNA在视前区、下丘脑和垂体区域有表达。此外，利用基于PCR方法的基因步移法克隆了草鱼脑芳香化酶基因5’端的上游序列。所获得的启动子序列共有23KB，其中包括了1个TATA框，1个CAAT框以及许多潜在的转录因子结合位点，包括GATAS，AP1，ERE，CRE，C/EBP，NF1,SP1,PPARALPHA/RXRALPHA,SREBP1,GP,NFKAPPAB,AHR/ARNT,STATX元件和CREBP1/CJUN等等。此外，实验结果显示，GCP450AROMB基因的翻译从第二个外显子开始，与不翻译的第一个外显子之间存在一个较长的内含子，大约有27KB。草鱼脑芳香化酶启动子活性的检测是以体外大鼠神经胶质瘤细胞C6为模型，对5’端上游序列采取5’端逐渐缺失片段构建荧光素酶报告基因的表达质粒来完成。结果显示，与阴性对照PGL3BASIC相比，几乎所有包括了第一个内含子全部序列的报告质粒都表现出不同程度的转录活性，而仅含有启动子序列的的报告质粒都没有转录活性。实验中还初步探讨了下丘脑分泌因子PACAP和垂体分泌激素STH、GTH和ACTIVIN对调控序列转录活性的影响，表明PACAP在调控序列缺失到PGL3159/2822后一直表现为明显的抑制作用，而GTH对不同长短的启动子序列的转录水平都呈现出抑制作用，特别是在PGL31855/2822抑制效果尤为显著。与之不同的是，生长激素STH在报告质粒PGL3828/2822显示出明显的促进作用。但是这种作用在进一步的缺失后被阻断，甚至在861/1855出明显的促进作用。但是这种作用在进一步的缺失后被阻断，甚至在861/1855区域缺失后转为抑制作用。出乎意料的是，ACTIVIN对草鱼脑芳香化酶的转录调节效果与生长激素的相类似。

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